近年來(lái)，全球化妝品行業(yè)高速蓬勃發(fā)展，不斷涌現(xiàn)的創(chuàng)新技術(shù)與前沿方法持續(xù)引領(lǐng)著化妝品原料與配方的革新，成分更復(fù)雜、功能更多樣化的新產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。這些變化不僅極大地豐富了市場(chǎng)供應(yīng)，同時(shí)也對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)與監(jiān)管工作提出了新的要求?；瘖y品安全性和功效性檢測(cè)的重要性不言而喻。因此，為積極響應(yīng)我國(guó)“兩品一械”（涵蓋藥品、化妝品及醫(yī)療器械）新法規(guī)的全面落實(shí)，并緊跟全球化妝品產(chǎn)業(yè)最新動(dòng)態(tài)，研發(fā)并推出更加嚴(yán)謹(jǐn)、高效的化妝品原料評(píng)價(jià)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
已知皮膚是我們?nèi)梭w最大的器官，由表皮、真皮和皮下組織三部分構(gòu)成。作為保護(hù)人體的第一道防線，皮膚經(jīng)常直接接觸多種化學(xué)和生物物質(zhì)，包括化妝品、紫外線、病原體、環(huán)境污染物、微生物和洗滌劑等，從而引發(fā)如炎癥、過(guò)敏反應(yīng)、衰老和癌癥等問(wèn)題。因此，為評(píng)估某些原料的安全性或檢測(cè)化妝品的功效性，需要進(jìn)行皮膚測(cè)試。
圖1 皮膚衰老的相關(guān)作用機(jī)制（圖片來(lái)源網(wǎng)絡(luò)）
此前，通常借助動(dòng)物皮膚代替人體皮膚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2019年，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局宣布將從2035年開(kāi)始停止支持使用哺乳動(dòng)物進(jìn)行安全性測(cè)試的研究。隨著“3Rs原則”（reduction，replacement，refinement）的提出，越來(lái)越多的國(guó)家考慮到動(dòng)物福利，倡導(dǎo)盡量減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。而且小鼠與人體皮膚厚度和毛發(fā)均存在明顯差異，除腳墊之外沒(méi)有汗腺。因此，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定、能夠模擬人類的體外皮膚模型以替代化妝品行業(yè)中傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)變得尤為重要。
體外皮膚模型的發(fā)展始于20世紀(jì)40年代，最初的嘗試源于對(duì)成年哺乳動(dòng)物皮膚上皮的體外培養(yǎng)。1975年，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出了使用成纖維細(xì)胞的二維皮膚模型；隨后的第二年，首個(gè)三維皮膚模型問(wèn)世，這一模型更接近真實(shí)皮膚的結(jié)構(gòu)和功能。自那以后，研究者們陸續(xù)開(kāi)發(fā)出多種類型的人類皮膚等效物，這些模型被廣泛用于評(píng)估化妝品的安全性和功效性，有效推動(dòng)了化妝品行業(yè)的科技進(jìn)步和動(dòng)物福利的提升。
其中，人體體外皮膚模型的發(fā)展可以概括為幾個(gè)具有代表性的階段：二維皮膚模型（2D細(xì)胞培養(yǎng)）、三維皮膚模型、皮膚類器官（Organoids）、器官芯片（Organs-on-chips，OOC）、3D生物打印、傳統(tǒng)皮膚芯片（skin-on-chip，SoC）和新型皮膚芯片。
2D細(xì)胞培養(yǎng)一直是培養(yǎng)細(xì)胞的常用方法，這種模型主要涉及在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)皮膚細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，成本較低，便于觀察細(xì)胞行為和進(jìn)行基礎(chǔ)的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，但不能模擬皮膚的三維結(jié)構(gòu)，且缺乏細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)之間的交流相互作用，因此生理相關(guān)性較低。
在2D細(xì)胞基礎(chǔ)上，三維皮膚模型將細(xì)胞、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、再造基質(zhì)蛋白以及適合的骨架混合在一個(gè)體系中進(jìn)行共同培養(yǎng)，更貼近真實(shí)的皮膚結(jié)構(gòu)，能夠模擬表皮和真皮層的相互作用，提高了模型的生理相關(guān)性。但三維皮膚模型缺乏血管系統(tǒng)，易出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)和代謝物交換受限、藥物滲透和分布不真實(shí)、炎癥和免疫反應(yīng)模擬不足及修復(fù)再生能力有限等缺點(diǎn)。
類器官（Organoids）和器官芯片（Organ-on-a-chip）是兩種先進(jìn)的生物模型，用于研究人體器官的功能、疾病發(fā)展以及藥物測(cè)試，但其構(gòu)建和應(yīng)用方式有所不同。
類器官是一種三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由來(lái)源于干細(xì)胞或器官特定干細(xì)胞的細(xì)胞在體外培養(yǎng)而成，能夠模擬真實(shí)器官的微觀結(jié)構(gòu)和功能。類器官?gòu)V泛應(yīng)用于疾病建模、生理功能研究和藥物篩選等領(lǐng)域。但可能缺乏完整的血管系統(tǒng)，難以完全再現(xiàn)器官的所有生理和病理功能。
圖2 構(gòu)建皮膚類器官的主要細(xì)胞來(lái)源（圖片來(lái)源網(wǎng)絡(luò)）
器官芯片是一種微流控芯片，通過(guò)在微型芯片上構(gòu)建生物活性的微型環(huán)境來(lái)模擬人體器官的生理和機(jī)械功能。芯片通常由透明聚合物制成，內(nèi)部含有微型通道，可以流動(dòng)細(xì)胞和培養(yǎng)基，模擬血液流動(dòng)等生理?xiàng)l件，精確控制細(xì)胞環(huán)境和外部物理?xiàng)l件，如流體力學(xué)和機(jī)械壓力。然而，器官芯片雖然可以模擬單個(gè)或多個(gè)器官的相互作用，但構(gòu)建復(fù)雜的多器官系統(tǒng)仍具挑戰(zhàn)性。
圖3 不同細(xì)胞構(gòu)建的器官芯片
3D生物打印將3D打印與生物醫(yī)學(xué)結(jié)合起來(lái)，利用醫(yī)學(xué)成像技術(shù)如核磁共振或斷層掃描獲得三維數(shù)據(jù)，活細(xì)胞和生物材料作為“生物墨水”，層層精確堆砌得到3D結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)模型相比，3D生物打印顯示出更高的靈活性、可重復(fù)性、分辨率以及能夠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的能力。但該模型同樣因缺乏血管系統(tǒng)存在部分缺點(diǎn)。
微流控皮膚芯片是一種利用微流控技術(shù)模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。這種芯片包含微小的流道和腔室，可以通過(guò)控制參數(shù)如培養(yǎng)基流動(dòng)、機(jī)械力、生物化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度等模擬真實(shí)人體皮膚的三維培養(yǎng)微環(huán)境。精確控制流體的流動(dòng)和環(huán)境條件，我們就可以在芯片上培養(yǎng)皮膚細(xì)胞，研究細(xì)胞間的相互作用、藥物輸送和病理狀態(tài)。微流控皮膚芯片應(yīng)用范圍廣泛，包括藥物篩選、毒理學(xué)測(cè)試、疾病模型研究以及化妝品安全和功效評(píng)估等。這種技術(shù)通過(guò)減少對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的依賴，不僅提高了實(shí)驗(yàn)的倫理性，還能提供更精確、更具人體相關(guān)性的研究結(jié)果。
圖4 微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖
皮膚芯片目前主要有兩種制作思路：
- 轉(zhuǎn)移皮膚芯片：將供體的皮膚活檢或人體皮膚等效物（human skin equivalents，HSEs）引入微流控系統(tǒng)，通過(guò)系統(tǒng)下方培養(yǎng)基動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。這類芯片直接采用供體的皮膚樣本，操作簡(jiǎn)便，但個(gè)體差異和體外存活問(wèn)題不容忽視。
- 原位皮膚芯片：在微流控系統(tǒng)內(nèi)部直接培養(yǎng)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞等，以此形成皮膚模型。該法通過(guò)統(tǒng)一的細(xì)胞培養(yǎng)減少了來(lái)自不同供體的個(gè)體差異和對(duì)供體皮膚的損傷，但培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，成本高，所生成的皮膚模型與真實(shí)人體皮膚之間仍存在一定差異，仍需不斷改進(jìn)。
圖5 皮膚芯片側(cè)視圖
此外，根據(jù)制備材料的不同，皮膚芯片被分為多種類型，我們將在后續(xù)推文中進(jìn)行詳細(xì)介紹，今天一起來(lái)看看新型微流控皮膚芯片在化妝品安全和功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用吧！
化學(xué)刺激評(píng)估
微流控皮膚芯片在安全性評(píng)估中主要作用于皮膚致敏性和刺激性試驗(yàn)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。
Jong Seung Lee 等構(gòu)建了一種皮膚-神經(jīng)和皮膚-肝臟復(fù)合模型人體皮膚芯片，該芯片結(jié)合了鈣成像以監(jiān)測(cè)神經(jīng)元活性、GSH/ROS分析評(píng)估肝臟毒性的分析技術(shù)，可實(shí)時(shí)定量分析皮膚對(duì)化學(xué)物質(zhì)的致敏性及化學(xué)物質(zhì)的潛在肝毒性，達(dá)到精確評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)皮膚毒理學(xué)影響的目的。
Jing Zhang 等通過(guò)在微流控系統(tǒng)中直接培養(yǎng)和分化人類角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建出一款高度仿真表皮芯片，并對(duì)10種已知的毒性和非毒性物質(zhì)進(jìn)行體外細(xì)胞毒性刺激測(cè)試，深入分析評(píng)估炎癥因子的釋放。該皮膚芯片可以作為體外皮膚刺激評(píng)估的有效替代工具。
圖6（a）混合皮膚模型單元設(shè)計(jì)和六單元并聯(lián)全芯片；（b）高仿真表皮芯片結(jié)構(gòu)
Mc Cormick 等利用微流控技術(shù)和可透過(guò)紫外線（UV）的石英基底裝置構(gòu)建暴露于多種不同外部條件的多通道皮膚芯片，測(cè)定單參數(shù)暴露（UV或納米二氧化鈦）和多參數(shù)暴露（UV和不同濃度的納米二氧化鈦）下人表皮細(xì)胞（HaCaT）的毒性反應(yīng)。
圖7 不同紫外線曝光方法的圖示：（a）生物安全柜頂部向下的紫外線照射96孔板；（b）光臺(tái)底部向上的紫外線照射微流控芯片；（c）為孔板照片；（d）為微流控設(shè)備照片
有效成分篩選
化妝品開(kāi)發(fā)過(guò)程中，有效活性成分的篩選需要花費(fèi)大量時(shí)間，微流控平臺(tái)的開(kāi)發(fā)能夠有效提升篩選效率。Chen 等在芯片上培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞球體（dermal fibroblast sphere，DFS），而后將不同濃度的維生素C加入微室，探究其對(duì)DFS產(chǎn)生I型膠原蛋白和纖維連接蛋白的影響。該方法能夠在3天內(nèi)高效地篩選出維生素C對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用。此外，該芯片能夠?qū)?2種不同的成分或組合進(jìn)行高通量篩選，極大地縮短了化妝品的研發(fā)周期。
圖8 支持真皮成纖維細(xì)胞球培養(yǎng)的四聯(lián)體芯片
透皮吸收
透皮吸收實(shí)驗(yàn)可以測(cè)試化妝品中活性成分能否有效穿透皮膚并達(dá)到預(yù)期的皮膚層，從而發(fā)揮作用效果，包括在體內(nèi)的積累情況及可能的副作用，對(duì)于證明產(chǎn)品的功效聲明、確保成分安全至關(guān)重要。Franz擴(kuò)散池法是目前最常用的透皮吸收測(cè)試方法，它使用雙室系統(tǒng)，一室裝有待測(cè)試化妝品，另一室裝有接收介質(zhì)。兩室之間通過(guò)皮膚（可以是動(dòng)物皮膚或人體皮膚）隔開(kāi)。測(cè)量從供給室通過(guò)皮膚到接收室的活性成分遷移量，評(píng)估待測(cè)物的透皮吸收能力。
但Franz擴(kuò)散池法不能模擬皮膚的生理環(huán)境，如血液供應(yīng)和代謝活動(dòng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際情況出現(xiàn)偏差。且動(dòng)物皮膚與人類皮膚在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，可能涉及倫理問(wèn)題。采用皮膚芯片不僅可以避免倫理問(wèn)題和物種間差異，還能更有效地模擬皮膚微循環(huán)，多通道系統(tǒng)允許同時(shí)多個(gè)樣品的測(cè)試，大大提高實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確度。
Bajza等所開(kāi)發(fā)的基于聚二甲基硅氧烷的微流控芯片可用于局部化妝品經(jīng)皮吸收的體外/離體監(jiān)測(cè)，并可以根據(jù)具體需求部分改裝。實(shí)驗(yàn)研究了兩種P-糖蛋白底物模型藥物（奎尼丁和紅霉素）在糖蛋白抑制劑存在和不存在條件下的透皮吸收曲線。結(jié)果表明，P-糖蛋白在皮膚中具有吸收方向性，局部抑制劑可改變其作用。該微流控?cái)U(kuò)散室能夠用于探究皮膚芯片微流控系統(tǒng)與透皮成分傳遞及真皮屏障中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的交互作用，在評(píng)估化妝品透皮吸收方面具有重要應(yīng)用潛力。
圖9 “皮膚芯片”微流控?cái)U(kuò)散池結(jié)構(gòu)示意圖
抗衰功效評(píng)估
隨著社會(huì)進(jìn)步和人們生活水平的提高，皮膚抗衰領(lǐng)域近年來(lái)取得了顯著發(fā)展。抗衰意識(shí)逐漸深入人心，護(hù)膚品市場(chǎng)不斷細(xì)分，針對(duì)不同膚質(zhì)、不同年齡及不同部位抗衰需求的護(hù)膚品層出不窮。人們希望通過(guò)使用化妝品來(lái)減緩皮膚老化進(jìn)程，維持皮膚健康和年輕態(tài)，關(guān)于抗衰的研究也在持續(xù)進(jìn)行。
Kim 等研發(fā)出一種模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的“無(wú)泵皮膚芯片”用于化妝品測(cè)試。該模型是利用人原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的由真皮和表皮組成的皮膚等效模型。利用重力流裝置將介質(zhì)以兩邊15°的角度旋轉(zhuǎn)，使其通過(guò)無(wú)泵的片上皮膚微流控通道循環(huán)流動(dòng)。使用天然產(chǎn)物化妝品成分姜黃葉提取物進(jìn)行測(cè)試，評(píng)估該成分的功效。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚表皮層的屏障功能增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出抗衰老作用。
圖10 微流控芯片裝置示意圖
β-半乳糖苷酶是一種通常用于監(jiān)測(cè)衰老的生物標(biāo)志物，其表達(dá)隨細(xì)胞衰老程度的加劇而升高。Subin Jeong 等通過(guò)構(gòu)建基于人類成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的全層三維柔性皮膚芯片，使用光交聯(lián)劑和周期性機(jī)械刺激加速全層皮膚老化，復(fù)制28天晝夜節(jié)律。在28天對(duì)比培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，觀察到全層皮膚模型的收縮和表皮層厚度均有所減少，同時(shí)β-半乳糖苷酶基因表達(dá)增加，詳細(xì)記錄了皮膚老化過(guò)程。這一新型皮膚芯片老化模型的應(yīng)用，有助于揭示老化新機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)抗老化化妝品具有重要應(yīng)用價(jià)值。
美白功效評(píng)估
圖11 皮膚衰老模型培養(yǎng)過(guò)程：使用機(jī)械刺激驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行周期性壓縮刺激12 h，并在非刺激狀態(tài)下保持12 h
皮膚是保護(hù)人體免受紫外線輻射（UVR）的重要器官。黑色素的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致黃褐斑等疾病。色素沉著已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，與此同時(shí)，出于對(duì)美麗和健康的考慮，美白化妝品對(duì)公眾越來(lái)越有吸引力。
Qiwei Li 等開(kāi)發(fā)出一種自動(dòng)化的仿生人體微生理系統(tǒng)（MPS），該系統(tǒng)可用于構(gòu)建體外皮膚模型并提高仿生性能?；谌孜⒘骺氐谋砥ば酒‥oC）系統(tǒng)具有表皮屏障和仿黑色素功能，適用于膏狀和半固態(tài)物質(zhì)，同時(shí)也允許長(zhǎng)期培養(yǎng)和成像。系統(tǒng)中表皮層分化良好，包括基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層，相應(yīng)層中表皮標(biāo)記物（例如角蛋白-10、角蛋白-14、角化蛋白、鱗狀蛋白）表達(dá)水平適當(dāng)。該團(tuán)隊(duì)使用此表皮芯片測(cè)試了一種化妝品的美白效果，通過(guò)表征與分析證明了化妝品在減少黑色素合成方面的功效。同時(shí)還使用該表皮芯片測(cè)試了四種化學(xué)物質(zhì)的刺激和滲透特性。結(jié)果證明，該仿生EoC系統(tǒng)可作為皮膚刺激、滲透性、化妝品評(píng)估和藥物安全測(cè)試的有用工具。
圖12 （a）三單元表皮芯片結(jié)構(gòu)圖；（b）化妝品美白測(cè)試后皮膚芯片光學(xué)圖片：（i）陰性對(duì)照，（ii） 陽(yáng)性對(duì)照，（iii）試驗(yàn)組，（iv）空白對(duì)照
皮膚芯片技術(shù)在化妝品安全和功效性評(píng)估方面的應(yīng)用，標(biāo)志著體外測(cè)試方法的一大進(jìn)步，這種方法通過(guò)模擬人體皮膚的關(guān)鍵特性和功能，為化妝品安全性和功效性評(píng)估提供了一種高效、精確且符合倫理的新方法。不僅有助于提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性，還推動(dòng)了化妝品測(cè)試領(lǐng)域向更科學(xué)和人性化的方向發(fā)展。相信在未來(lái)，微流控皮膚芯片作為一種高度模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的先進(jìn)技術(shù)，會(huì)擁有更廣闊的發(fā)展前景。
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